Florence ble foreldreløs som tolvåring og viste tidlig interesse for arkitektur. Hun gikk på Kingswood School for Girls ved Cranbrook Academy of Art, hvor hun ble venn med Eliel Saarinen. Hun studerte senere under ham ved Cranbrook, og fikk nære bånd til hans sønn, Eero Saarinen.

Med anbefalinger fra Eliel Saarinen og Alvar Aalto, studerte Florence videre hos noen av de største arkitektene i det 20. århundre, inkludert Walter Gropius, Marcel Breuer og Ludwig Mies van der Rohe. I 1941 flyttet hun til New York og møtte Hans Knoll, som hun giftet seg med i 1946. Sammen bygde de opp Knoll til et internasjonalt møbelfirma.

Florence Knoll etablerte det revolusjonerende Knoll Planning Unit, som satte standarden for moderne bedriftsinteriør i etterkrigstidens Amerika. Hun introduserte effektivitet, romplanlegging og helhetlig design til kontorplanlegging. Florence skapte interiører for store selskaper som IBM, GM og CBS og bidro også med møbeldesign til Knoll-katalogen, som senere ble like anerkjent som verkene til hennes kolleger.

Etter Hans Knolls død i 1955, ledet Florence selskapet gjennom usikre tider som president. Hun trakk seg tilbake i 1965 etter å ha definert landskapet og estetikken for bedriftskontorer. Hennes bidrag til Knoll og modernismens fremvekst i Amerika er uvurderlige.